Η σημαντικότητα του σωστού χειρισμού του αρχαίου βιολογικού ανασκαφικού υλικού για την επιτυχημένη ανάλυση αρχαίου DNA.

H διατήρηση του οργανικού αρχαιολογικού/παλαιοντολογικού υλικού επηρεάζεται από πολλές ταφονομικές διαδικασίες τόσο μακροσκοπικά (δείγμα) όσο και σε μοριακό επίπεδο (πρωτεΐνες, DNA). Επομένως, η καλή βιομοριακή διατήρηση είναι η εξαίρεση και όχι ο κανόνας, η οποία εξαρτάται από δύο βασικούς παράγοντες: τις περιβαλλοντικές συνθήκες και το χρόνο. Η αποσύνθεση του DNA ξεκινά αμέσως μετά το θάνατο, όταν ένζυμα του ίδιου του οργανισμού, αλλά και μικροβίων αρχίζουν την αποικοδόμηση των μορίων DNA. Αυτή η βιοχημική αποδόμηση περιορίζεται κάτω από συγκεκριμένες περιβαλλοντικές συνθήκες (ταχεία αποξήρανση ή χαμηλή θερμοκρασία), ωστόσο πιο αργές διαδικασίες, όπως η οξείδωση και η υδρόλυση, επιδρούν στο DNA ανεξάρτητα από τις συνθήκες. Η οξείδωση και η υδρόλυση επηρεάζουν σε μεγάλο βαθμό τη δομή και τη σταθερότητα του DNA με αποτέλεσμα την περαιτέρω υποβάθμιση, συμπεριλαμβανομένων των τροποποιήσεων στις ίδιες τις αλληλουχίες του DNA.

Ως αποτέλεσμα, τα ελάχιστα εναπομείναντα θραύσματα DNA, τα οποία δύναται να ανακτηθούν από αρχαίο βιολογικό υλικό είναι πολύ μικρά σε μέγεθος, ενώ η ακεραιότητά τους έχει χαθεί, κάτι που οδηγεί σε αλλοιωμένη γενετική πληροφορία. Ακόμα πιο σημαντικό είναι ότι μόρια DNA του περιβάλλοντος (π.χ. από το χώμα που κάλυπτε το δείγμα) ή από ανθρώπους που χειρίζονται τα δείγματα, μπορούν να υπερκεράσουν τη μικρή ποσότητα ενδογενούς αρχαίου DNA.

Μοντέρνο ανθρώπινο DNA μπορεί να βρεθεί σε νεκρά κύτταρα του δέρματος, τρίχες, σάλιο, πιτυρίδα, ιδρώτα και αίμα των ανθρώπων. Όλες οι προφυλάξεις που λαμβάνονται εντός του Εργαστηρίου Αρχαίου DNA για τον έλεγχο και την ελαχιστοποίηση τόσο του περιβαλλοντικού όσο και του ανθρώπινου DNA, δεν μπορούν να ξεπεράσουν εντελώς την επιμόλυνση του DNA που μπορεί να συμβεί κατά τη διάρκεια της συλλογής των δειγμάτων στις ανασκαφές και της μετέπειτα φύλαξής τους.

Είναι θεμιτό και απαραίτητο να λαμβάνονται προφυλάξεις επιμόλυνσης τόσο στο εργαστήριο όσο και στο ανασκαφικό πεδίο έτσι ώστε να διατηρείται η ακεραιότητα του δείγματος για τις επόμενες γενιές ερευνητών, ακόμα και αν δεν αναμένεται άμεσα μια ανάλυση αρχαίου DNA ή κατά τη διάρκεια μιας ανασκαφικής περιόδου. Για παράδειγμα, η ανάπτυξη μικροβιακού φορτίου μετά την ανασκαφή ή αχρείαστη υποβάθμιση του ενδογενούς DNA μπορεί να επηρεάσει την αναλογία ενδογενούς – εξωγενούς DNA, κάτι που έχει σοβαρές επιπτώσεις στο, ήδη υψηλό, κόστος της ανάλυσης αρχαίου DNA.

Παρακάτω, προτείνουμε κάποιες οδηγίες και προφυλάξεις, οι οποίες απευθύνονται τόσο στους αρχαιολόγους που δουλεύουν στο ανασκαφικό πεδίο, όσο και στους φυσικούς ανθρωπολόγους και τους εφόρους των μουσείων που χειρίζονται τα δείγματα μετά την μεταφορά τους από την ανασκαφή.

 

Κατάλογος προφυλάξεων και οδηγιών για την αποφυγή επιμολύνσεων DNA του αρχαίου βιολογικού υλικού κατά τη διάρκεια της ανασκαφής, της μεταφοράς, του χειρισμού στο μουσείο και της φύλαξης.

Οι περισσότερες συστάσεις που αναφέρονται παρακάτω μπορούν να ενσωματωθούν στη ρουτίνα της πλειονότητας των αρχαιολογικών ανασκαφών. Ωστόσο, η πραγματικότητα στην αρχαιολογία πεδίου συχνά απέχει πολύ από την «ιδανική» ανασκαφή, είτε λόγω του ίδιου του χαρακτήρα της ανασκαφής (π.χ. ανάμειξη των βιολογικών κατάλοιπων, υγρές σπηλιές), είτε λόγω ανθρωποκεντρικών δυσκολιών (π.χ. περιορισμένη χρηματοδότηση, έλλειψη προσωπικού).

Επομένως, προτείνονται στους αρχαιολόγους ως γενικές αρχές, τα δύο παρακάτω σημεία:

Α) Προστατέψτε τα δείγματα από την επιμόλυνση

Β) Εμποδίστε την περαιτέρω υποβάθμιση του ενδογενούς αρχαίου DNA

 

Προφυλάξεις που δυνητικά μπορούν να κάνουν μεγάλη διαφορά:

Γάντια μιας χρήσης: Κάθε μέλος της ανασκαφής που έρχεται σε επαφή με αρχαιοβιολογικά δείγματα θα πρέπει να φορά ιατρικά γάντια μιας χρήσης κατά τη διάρκεια της ανασκαφής. Τα γάντια θα πρέπει να αλλάζονται οπωσδήποτε μεταξύ δειγμάτων/ατόμων, αλλά και στην περίπτωση επαφής με τα μαλλιά ή το πρόσωπό ή με κοινά αντικείμενα (π.χ. στυλό). Η χρήση δύο ζευγαριών γαντιών και η συχνή αλλαγή του δεύτερου είναι αποδοτική, επειδή η χρήση γαντιών με ιδρωμένα χέρια είναι συνήθως δύσκολη.

Αποφυγή πλυσίματος των δειγμάτων: Το νερό περιέχει βακτηριακό DNA και μπορεί να διεισδύσει βαθιά εντός του δείγματος προκαλώντας βλάβες υδρόλυσης στο ενδογενές DNA, καθώς και να ωθήσει πιο βαθιά εντός του δείγματος πιθανές επιμολύνσεις. Το απαλό βούρτσισμα των δειγμάτων με μια στεγνή βούρτσα προτιμάται. Ωστόσο, δε θα πρέπει να αφαιρείται η οδοντική πέτρα από τα δόντια και να αποφεύγεται το τρίψιμο των δοντιών με βούρτσες.

Αποθήκευση: Τα δείγματα πρέπει να είναι είτε απολύτως ξηρά για την αποφυγή ανάπτυξης μικροβιακού φορτίου και βλαβών, ή να φυλάσσονται σε κρύο, ξηρό μέρος όσο το δυνατόν γρηγορότερα (π.χ. σε κατάψυξη ή ψυγείο).

 

Προαιρετικές προφυλάξεις για μέγιστο αποτέλεσμα:

Ένδυση προστασίας: Εκτός από τα γάντια, άλλα (προαιρετικά) είδη μίας χρήσης είναι η χειρουργική μάσκα προσώπου, κάλυμμα/δίχτυ μαλλιών και μανίκια που φτάνουν έως τους ώμους. Εάν ο προϋπολογισμός το επιτρέπει, επιθυμητή είναι και η στολή μιας χρήσης.

Προστασία της θέσης: Εφόσον το δείγμα έχει αποκαλυφθεί, θα πρέπει να προστατεύεται η θέση που βρέθηκε από σκόνη, βροχή και έντονη ηλιοφάνεια για να περιοριστεί η υδρόλυση, η βλάβη λόγω ακτινοβολίας και η περαιτέρω επιμόλυνση με περιβαλλοντικό DNA.

Εξειδικευμένο και εκπαιδευμένο προσωπικό: Εάν είναι δυνατό, προτείνεται να ορίζονται ένα ή δύο μέλη της ανασκαφικής ομάδας ή της εφορίας να αποκτήσουν κατάλληλη εκπαίδευση (μέσω ενός πρακτικού σεμιναρίου για παράδειγμα) έτσι ώστε να είναι οι μοναδικά υπεύθυνοι για τη συλλογή των «δειγμάτων χωρίς επιμόλυνση» που θα προορίζονται για ανάλυση αρχαίου DNA. Έτσι περιορίζεται η επιμόλυνση από πολλαπλά άτομα.

Καθαρά εργαλεία: Μεταξύ των δειγμάτων/ατόμων καθαρίστε τα εργαλεία σας (π.χ. βούρτσες, μαχαίρια) με ≥3% διάλυμα χλωρίνης και στεγνώστε τα πριν τη χρήση σε επόμενο δείγμα. Η οξειδωτική δύναμη της χλωρίνης καταστρέφει τις DNA επιμολύνσεις.

Αρχείο: Θα πρέπει να γίνεται καταγραφή του τύπο εδάφους, των υγρών/ξηρών συνθηκών, των χειρισμών των δειγμάτων κ.α.

Δειγματοληψία in situ: Η in situ δειγματοληψία του δείγματος που θα σταλεί για ανάλυση αρχαίου DNA (π.χ. δόντι, ή κροταφικό οστό) προτιμάται έναντι της δειγματοληψίας στο μουσείο. Σε αυτές τις περιπτώσεις:

Εφόσον έχει αποκαλυφθεί ο σκελετός και έχει αναγνωριστεί η κατεύθυνση του σώματος, θα πρέπει να γίνεται πρώτα η συλλογή του δείγματος που προορίζεται για ανάλυση αρχαίου DNA και στη συνέχεια η συλλογή του υπόλοιπου σκελετού.

Στην περίπτωση πολλαπλών ατόμων (π.χ. μαζική ταφή), πρέπει να προστατεύονται τα κρανία κατά τη διάρκεια της ανασκαφής μέχρι τον εντοπισμό όλων των ατόμων. Τα δείγματα που λαμβάνονται για ανάλυση αρχαίου DNA πρέπει να επιλέγονται με τέτοιο τρόπο ώστε να είναι σίγουρη η αντιστοίχισή τους με το κάθε άτομο (π.χ. πιθανότατα επιλογή δοντιών και κροταφικού οστού).

Συνθήκες αποθήκευσηςΑν το δείγμα είναι πολύ υγρό, θα πρέπει να φυλάσσεται άμεσα σε καταψύκτη. Ωστόσο, θα πρέπει να αποφεύγονται ή να ελαχιστοποιούνται οι αλλεπάλληλές ψύξεις και αποψύξεις, καθώς η κρυστάλλωση και η αποκρυστάλλωση του νερού προωθεί τη διαγένεση των οστών. Εάν δεν υπάρχει η δυνατότητα χρήσης καταψύκτη, το δείγμα μπορεί να τυλίγεται σε ειδικό χαρτί (acid free) ή ελλείψει αυτού σε καθαρό χαρτί κουζίνας και να αφήνεται να αποξηραθεί σε ένα καθαρό χώρο (όχι στον ήλιο) για να παρεμποδιστεί η ανάπτυξη μούχλας. Προσοχή στην πιθανότητα να ξεχαστεί το δείγμα τυλιγμένο και να μην φυλαχτεί μετά την αποξήρανση.

Η αποθήκευση του κάθε δείγματος θα πρέπει να γίνεται ξεχωριστά σε καθαρή, ξηρή και αεροστεγή σακούλα (π.χ. αυτές που κλείνουν με «ζιπ») για την αποφυγή επιμόλυνσης μεταξύ δειγμάτων.

Σε κάθε δείγμα θα πρέπει να καθαρογράφεται η ημερομηνία, η τοποθεσία, ο τύπος δείγματος (π.χ. δόντι), το όνομα των ανασκαφέων και όποια άλλη πληροφορία κρίνεται απαραίτητη.

Χειρισμός με χημικά: Η χρήση συντηρητικών, σκληρυντικών, βερνικιών, κόλλας η κολλητικών ταινιών ή όποιου άλλου χημικού παράγοντα πρέπει να αποφεύγεται, καθώς μπορεί να παρεμποδίσει την ενζυματική δράση των εργαστηριακών αντιδραστηρίων ή να εισάγει επιμολύνσεις.

Μουσειακά δείγματα: Δείγματα που φυλάσσονται σε μουσεία ή σε άλλες εγκαταστάσεις είναι εξαιρετικά πολύτιμα για τη μελέτη του αρχαίου DNA, παρά την πιθανή απώλεια πληροφορίας τεκμηρίωσης (π.χ. ελλιπής καταγραφή και σχολιασμός του βιολογικού υλικού), την αποθήκευση σε θερμοκρασία δωματίου και τον εκτεταμένο χειρισμό του δείγματος με γυμνά χέρια. Κατά τη διάρκεια δειγματοληψίας μουσειακών δειγμάτων με σκοπό την ανάλυση αρχαίου DNA, προτείνεται η εφαρμογή των προαναφερθέντων οδηγιών.

Οι παραπάνω πληροφορίες προέρχονται από την εργασία των Llamas et al. 2017 From the field to the laboratory Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high throughput sequencing era, STAR: Science & Technology of Archaeological Research, 3:1, 1-14, DOI: 10.1080/20548923.2016.1258824. Περισσότερες πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στο παραπάνω άρθρο ακολουθώντας αυτόν τον υπερσύνδεσμο.

Back to top