Η σημαντικότητα του σωστού χειρισμού του αρχαίου βιολογικού ανασκαφικού υλικού για την επιτυχημένη ανάλυση αρχαίου DNA.

H διατήρηση του οργανικού αρχαιολογικού/παλαιοντολογικού υλικού επηρεάζεται από πολλές ταφονομικές διαδικασίες τόσο μακροσκοπικά (π.χ. στα οστά) όσο και σε μοριακό επίπεδο (π.χ. στις πρωτεΐνες και το DNA). Επομένως, η καλή βιομοριακή διατήρηση είναι η εξαίρεση και όχι ο κανόνας, η οποία εξαρτάται από δύο βασικούς παράγοντες: τις περιβαλλοντικές συνθήκες και το χρόνο.

Η αποσύνθεση του DNA ξεκινά αμέσως μετά το θάνατο, όταν ένζυμα του ίδιου του οργανισμού, αλλά και μικροβίων, αρχίζουν την αποικοδόμηση των μορίων DNA. Αυτή η βιοχημική αποδόμηση περιορίζεται κάτω από συγκεκριμένες περιβαλλοντικές συνθήκες (ταχεία αποξήρανση ή χαμηλή θερμοκρασία), ωστόσο πιο αργές διαδικασίες, όπως η οξείδωση και η υδρόλυση, επιδρούν στο DNA ανεξάρτητα από τις συνθήκες. Η οξείδωση και η υδρόλυση επηρεάζουν σε μεγάλο βαθμό τη δομή και τη σταθερότητα του DNA με αποτέλεσμα την περαιτέρω φθορά, συμπεριλαμβανομένων των τροποποιήσεων στις ίδιες τις αλληλουχίες του DNA.

Ως αποτέλεσμα, τα ελάχιστα εναπομείναντα θραύσματα DNA, τα οποία δύναται να ανακτηθούν από αρχαίο βιολογικό υλικό είναι πολύ μικρά σε μέγεθος, ενώ η ακεραιότητά τους έχει χαθεί, κάτι που οδηγεί σε αλλοιωμένη γενετική πληροφορία. Ακόμα πιο σημαντικό είναι ότι μόρια DNA του περιβάλλοντος (π.χ. από το χώμα που κάλυπτε το δείγμα) ή από ανθρώπους που χειρίζονται τα δείγματα, μπορούν να υπερκεράσουν τη μικρή ποσότητα ενδογενούς αρχαίου DNA. Μοντέρνο ανθρώπινο DNA μπορεί να βρεθεί σε νεκρά κύτταρα του δέρματος, τρίχες, σάλιο, πιτυρίδα, ιδρώτα και αίμα των ανθρώπων.

Όλες οι προφυλάξεις που λαμβάνονται εντός του Εργαστηρίου Αρχαίου DNA για τον έλεγχο και την ελαχιστοποίηση τόσο του περιβαλλοντικού όσο και του ανθρώπινου DNA, δεν μπορούν να ξεπεράσουν εντελώς την επιμόλυνση του DNA που μπορεί να συμβεί κατά τη διάρκεια της συλλογής των δειγμάτων στις ανασκαφές και της μετέπειτα φύλαξής τους.

Είναι θεμιτό και απαραίτητο να λαμβάνονται προφυλάξεις επιμόλυνσης, τόσο στο εργαστήριο όσο και στο ανασκαφικό πεδίο, έτσι ώστε να διατηρείται η ακεραιότητα του δείγματος για τις επόμενες γενιές ερευνητών -ακόμα και αν δεν αναμένεται άμεσα μια ανάλυση αρχαίου DNA- ή κατά τη διάρκεια μιας ανασκαφικής περιόδου. Για παράδειγμα, η ανάπτυξη μικροβιακού φορτίου μετά την ανασκαφή ή η αχρείαστη φθορά του ενδογενούς DNA μπορεί να επηρεάσει την αναλογία ενδογενούς – εξωγενούς DNA, κάτι που έχει σοβαρές επιπτώσεις στο, ήδη υψηλό, κόστος της ανάλυσης αρχαίου DNA.

Παρακάτω, προτείνουμε κάποιες οδηγίες και προφυλάξεις, οι οποίες απευθύνονται τόσο στους αρχαιολόγους που δουλεύουν στο ανασκαφικό πεδίο, όσο και στους φυσικούς ανθρωπολόγους και τους εφόρους των μουσείων που χειρίζονται τα δείγματα μετά την μεταφορά τους από την ανασκαφή.

 

Κατάλογος προφυλάξεων και οδηγιών για την αποφυγή επιμολύνσεων του αρχαίου βιολογικού υλικού κατά τη διάρκεια της ανασκαφής, της μεταφοράς, του χειρισμού στο μουσείο και της φύλαξης.

Οι περισσότερες συστάσεις που αναφέρονται παρακάτω μπορούν να ενσωματωθούν στη ρουτίνα της πλειονότητας των αρχαιολογικών ανασκαφών. Ωστόσο, η πραγματικότητα στην αρχαιολογία πεδίου συχνά απέχει πολύ από την «ιδανική» ανασκαφή, είτε λόγω του ίδιου του χαρακτήρα της ανασκαφής (π.χ. ανάμειξη των βιολογικών κατάλοιπων, υγρές σπηλιές), είτε λόγω ανθρωποκεντρικών δυσκολιών (π.χ. περιορισμένη χρηματοδότηση, έλλειψη προσωπικού).

• Σήμερα η αρχαιολογική κοινότητα είναι πλέον ενήμερη για τις απαιτήσεις συλλογής υλικού και δειγματοληψίας και συχνά τα μέλη της προγραμματίζουν τη συλλογή του υλικού τους ήδη κατά τη διάρκεια της ανασκαφής. Αυτό προϋποθέτει καλό σχεδιασμό δειγματοληψίας και την τήρηση κανόνων ορθής  πρακτικής που θα βοηθήσουν στην καλύτερη δυνατή δειγματοληψία. 
• Σήμερα γνωρίζουμε ότι στη λιθοειδή απόφυση ή λιθοειδή μοίρα (pars petrosa ή petrous bone, που βρίσκεται στο εσωτερικό μέρος του κροταφικού οστού, πίσω από τον ακουστικό πόρο. -Τα κροταφικά οστά βρίσκονται πλευρικά του κρανίου. Φιλοξενούν τα ακουστικά όργανα και αποτελούν το σημείο άρθρωσης με την κάτω γνάθο-), το DNA που σώζεται είναι  σε άριστη ποσότητα και ποιότητα. Άλλη καλή πηγή είναι τα δόντια, τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως στην έρευνα αρχαίου DNA.
• Για τους παραπάνω λόγους το υλικό που προτιμάμε να συλλέγουμε (εφόσον υπάρχουν οι κατάλληλες προϋποθέσεις) για την ανάκτηση αρχαίου DNA είναι τα ακέραια δόντια και η λιθοειδής απόφυση.
• Συνιστάται η αποφυγή της επιλογής οστών και δοντιών που είναι σπασμένα, πορώδη και εύθρυπτα, ή που φέρουν ίχνη αποχρωματισμού και ίχνη δράσης μικροοργανισμών π.χ. ταλαιπωρημένων από τη δράση περιβαλλοντικών παραγόντων όπως η υγρασία (ή το όξινο ταφικό περιβάλλον). Αυτό,  διότι εμφανίζουν μικρότερο ποσοστό επιτυχίας στην εκχύλιση DNA. Αντίθετα προτιμώνται τα ακέραια και συμπαγή οστά.

Ακολούθως, προτείνονται στους αρχαιολόγους ως γενικές αρχές, τα δύο παρακάτω σημεία:

Α) Προστατέψτε το οστεολογικό / οδοντικό υλικό από την επιμόλυνση

Β) Εμποδίστε την περαιτέρω φθορά του ενδογενούς αρχαίου DNA  

 

• Προφυλάξεις που δυνητικά μπορούν να κάνουν μεγάλη διαφορά:

Γενική Παρατήρηση: Οι αρχαιολόγοι δεν πρέπει να αγγίζουν το βιολογικό υλικό με γυμνά χέρια και τα εργαλεία που θα χρησιμοποιηθούν για τη δειγματοληψία θα πρέπει να καθαρίζονται, για να αποφεύγεται ο κίνδυνος α) επιμόλυνσης από τους ίδιους, και β) επιμόλυνση μεταξύ των δειγμάτων.

Γάντια μιας χρήσης: Κάθε μέλος της ανασκαφής που έρχεται σε επαφή με αρχαιοβιολογικό υλικό θα πρέπει να φορά ιατρικά γάντια μιας χρήσης κατά τη διάρκεια της ανασκαφής. Τα γάντια θα πρέπει να αλλάζονται οπωσδήποτε μεταξύ χειρισμού διαφορετικών ατόμων, όπως και στην περίπτωση επαφής με τα μαλλιά ή το πρόσωπό ή με κοινά αντικείμενα (π.χ. στυλό). Η χρήση δύο ζευγαριών γαντιών και η συχνή αλλαγή του δεύτερου είναι αποδοτική, επειδή η εφαρμογή γαντιών με ιδρωμένα χέρια είναι συνήθως δύσκολη. Η χρήση μάσκας προσώπου επίσης ενδείκνυται.

Αποφυγή πλυσίματος οστών και δοντιών: Το νερό περιέχει βακτηριακό DNA και μπορεί να διεισδύσει βαθιά εντός του δείγματος προκαλώντας βλάβες υδρόλυσης στο ενδογενές DNA, καθώς και να ωθήσει πιο βαθιά εντός του δείγματος πιθανές επιμολύνσεις από μοντέρνο DNA. Το απαλό βούρτσισμα των οστών με μια στεγνή βούρτσα προτιμάται. Ωστόσο, δε θα πρέπει να αφαιρείται η οδοντική πέτρα από τα δόντια και να αποφεύγεται το τρίψιμο των δοντιών με βούρτσες.

Χώρος αποθήκευσης: Για την αποφυγή ανάπτυξης μικροβιακού φορτίου και βλαβών, το  δείγματα μπορούν να φυλάσσονται σε κρύο, ξηρό δωμάτιο ή άλλο χώρο, εφόσον είναι απολύτως ξηρά, μέσα σε σακούλες. Σε περίπτωση δειγμάτων με υγρασία θα πρέπει πρώτα να αφήνονται να στεγνώσουν πλήρως με φυσικό τρόπο , ή να φυλάσσονται απευθείας σε σε κατάψυξη.  

 

• Προαιρετικές προφυλάξεις για μέγιστο αποτέλεσμα:

Ένδυση προστασίας: Εκτός από τα γάντια, άλλα (προαιρετικά) είδη μίας χρήσης είναι η χειρουργική μάσκα προσώπου, κάλυμμα/δίχτυ μαλλιών και μανίκια που φτάνουν έως τους ώμους. Εάν ο προϋπολογισμός το επιτρέπει, επιθυμητή είναι και η στολή μιας χρήσης.

Προστασία της θέσης: Εφόσον το βιολογικό ανασκαφικό υλικό (πχ σκελετός) έχει αποκαλυφθεί, θα πρέπει να προστατεύεται η θέση που βρέθηκε από σκόνη, βροχή και έντονη ηλιοφάνεια για να περιοριστεί η υδρόλυση, η βλάβη λόγω ακτινοβολίας και η περαιτέρω επιμόλυνση με περιβαλλοντικό DNA.

Εξειδικευμένο και εκπαιδευμένο προσωπικό: Εάν είναι δυνατό, προτείνεται να ορίζονται ένα ή δύο μέλη της ανασκαφικής ομάδας ή της εφορίας να αποκτήσουν κατάλληλη εκπαίδευση (μέσω ενός πρακτικού σεμιναρίου για παράδειγμα) έτσι ώστε να είναι οι μοναδικά υπεύθυνοι για τη συλλογή των «δειγμάτων χωρίς επιμόλυνση» που θα προορίζονται για ανάλυση αρχαίου DNA. Έτσι περιορίζεται η επιμόλυνση από πολλαπλά άτομα.

Καθαρά εργαλεία: Μεταξύ χειρισμού ανασκαφικού υλικού που ανήκει σε διαφορετικά άτομα καθαρίστε τα εργαλεία σας (π.χ. βούρτσες, μαχαίρια) με ≥3% διάλυμα χλωρίνης και στεγνώστε τα πριν τη χρήση σε επόμενο δείγμα. Η οξειδωτική δύναμη της χλωρίνης καταστρέφει τις DNA επιμολύνσεις. Τα μεταλλικά εργαλεία (π.χ. μαχαίρια) μπορούν επίσης να αποστειρωθούν με φλόγιστρο.

Τεκμηρίωση - Τήρηση Αρχείου: Θα πρέπει να γίνεται καταγραφή του τύπου εδάφους, των υγρών/ξηρών συνθηκών, των χειρισμών των δειγμάτων και γενικότερα οποιαδήποτε σχετικής πληροφορίας.

Δειγματοληψία in situ: Η in situ δειγματοληψία του δείγματος που θα σταλεί για ανάλυση αρχαίου DNA (π.χ. δόντι, ή κροταφικό οστό) προτιμάται έναντι της δειγματοληψίας στο μουσείο.

Σε αυτές τις περιπτώσεις:

Εφόσον έχει αποκαλυφθεί ο σκελετός και έχει αναγνωριστεί η κατεύθυνση του σώματος, θα πρέπει να γίνεται πρώτα η συλλογή του οστού/δοντιού που προορίζεται για ανάλυση αρχαίου DNA και στη συνέχεια η συλλογή των  υπόλοιπων τμημάτων του σκελετού.

Στην περίπτωση πολλαπλών ατόμων (π.χ. μαζική ταφή), πρέπει να προστατεύονται τα κρανία κατά τη διάρκεια της ανασκαφής μέχρι τον εντοπισμό όλων των ατόμων. Τα δείγματα που λαμβάνονται για ανάλυση αρχαίου DNA πρέπει να επιλέγονται με τέτοιο τρόπο ώστε να είναι σίγουρη η αντιστοίχισή τους με το κάθε άτομο (π.χ. πιθανότατα επιλογή δοντιών και κροταφικού οστού).

Συνθήκες αποθήκευσης: Αν το δείγμα είναι πολύ υγρό, θα πρέπει να φυλάσσεται άμεσα σε καταψύκτη. Ωστόσο, θα πρέπει να αποφεύγονται ή να ελαχιστοποιούνται οι αλλεπάλληλές ψύξεις και αποψύξεις, καθώς η κρυστάλλωση και η αποκρυστάλλωση του νερού προωθεί τη διαγένεση των οστών. Εάν δεν υπάρχει η δυνατότητα χρήσης καταψύκτη, το δείγμα μπορεί να τυλίγεται σε ειδικό χαρτί (acid free) ή ελλείψει αυτού σε καθαρό χαρτί κουζίνας και να αφήνεται να αποξηραθεί φυσικά σε ένα καθαρό χώρο (όχι στον ήλιο) για να παρεμποδιστεί η ανάπτυξη μούχλας. Προσοχή στην πιθανότητα να ξεχαστεί το δείγμα τυλιγμένο και να μην φυλαχτεί μετά την αποξήρανση.

Η αποθήκευση του κάθε οστεολογικού/οδοντικού δείγματος θα πρέπει να γίνεται ξεχωριστά σε καθαρή, ξηρή και αεροστεγή σακούλα (π.χ. αυτές που κλείνουν με «ζιπ») για την αποφυγή επιμόλυνσης μεταξύ δειγμάτων. Δείγματα από το ίδιο άτομο μπορούν να αποθηκευτούν στην ίδια σακούλα.

Σε κάθε δείγμα θα πρέπει να καθαρογράφεται η ημερομηνία, η τοποθεσία, ο τύπος δείγματος (π.χ. αριστερό κροταφικό, ή πρώτος αριστερός γομφίος άνω γνάθου ή βάσει διεθνούς κωδικοποίησης των δοντιών: δόντι 26), το όνομα των ανασκαφέων και όποια άλλη πληροφορία κρίνεται απαραίτητη.

Χειρισμός με χημικά: Η χρήση συντηρητικών, σκληρυντικών, βερνικιών, κόλλας η κολλητικών ταινιών ή όποιου άλλου χημικού παράγοντα πρέπει να αποφεύγεται, καθώς μπορεί να παρεμποδίσει την ενζυματική δράση των εργαστηριακών αντιδραστηρίων ή να εισάγει επιμολύνσεις.

Μουσειακά δείγματα: Δείγματα που φυλάσσονται σε μουσεία ή σε άλλες εγκαταστάσεις είναι εξαιρετικά πολύτιμα για τη μελέτη του αρχαίου DNA, παρά την πιθανή απώλεια πληροφορίας τεκμηρίωσης (π.χ. ελλιπής καταγραφή και σχολιασμός του βιολογικού υλικού), την αποθήκευση σε θερμοκρασία δωματίου και τον εκτεταμένο χειρισμό του δείγματος με γυμνά χέρια. Κατά τη διάρκεια δειγματοληψίας μουσειακών δειγμάτων με σκοπό την ανάλυση αρχαίου DNA, προτείνεται, όπου είναι δυνατόν, η εφαρμογή των προαναφερθέντων οδηγιών.

Οι παραπάνω πληροφορίες προέρχονται από την εργασία των Llamas et al. 2017 From the field to the laboratory Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high throughput sequencing era, STAR: Science & Technology of Archaeological Research, 3:1, 1-14, DOI: 10.1080/20548923.2016.1258824. Περισσότερες πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στο παραπάνω άρθρο ακολουθώντας αυτόν τον υπερσύνδεσμο.

 

Επιστημονικός Υπεύθυνος :
Καθ. Nίκος Πουλακάκης
Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Κρήτης
Email:	poulakakis[at]nhmc.uoc.gr
Fax:	+30-2810 391101
Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας και Βιοτεχνολογίας Ίδρυμα Τεχνολογίας και Έρευνας Α΄ κτήριο ανατολικού συγκροτήματος ΙΤΕ (Κτήριο ENISA) Οδός : Νικολάου Πλαστήρα 95, Βασιλικά Βουτών ΤΚ 700 13 ΕΛΛΑΔΑ

 

Προσωπικό	Θέση	Ηλεκτρονική Διεύθυνση	Τηλέφωνο
Aργυρώ Ναυπλιώτη	Συνυπεύθυνη έργου NEOMATRIX, Βιοαρχαιολογία, Επιστημονική Αρχαιολογία	argyro_nafplioti[at]imbb.forth.gr	+30 2811 392280
Δέσποινα Βάσσου	Μεταδιδακτορική ερευνήτρια, Υπεύθυνη Διαχείρισης εργαστηρίου	dvassou[at]imbb.forth.gr	+30 2810 391927
Ευγενία Ταμπακάκη	Αρχαιολόγος, Διαχείριση προγραμμάτων, Υπεύθυνη δειγματοληψιών	tabakaki[at]imbb.forth.gr	+30 2811 392280
Νικόλαος Ψώνης	Εξελικτικός βιολόγος, Μεταδιδακτορικός ερευνητής	nikos_psonis[at]imbb.forth.gr	+30 2810 391408
Σεβαστή Κουρσιώτη	Υπεύθυνη Διαχείρισης εργαστηρίου	koursioti.sev[at]gmail.com	+30 2810 391408

 

Συνεργαζόμενοι Φοιτητές	Ηλεκτρονική Διεύθυνση
Αγγελική Παπαδοπούλου	angeliki.papadop[at]gmail.com
Κατερίνα Χανιώτη	bio3546[at]edu.biology.uoc.gr
Στέφανος Παπαδαντωνάκης	spapadadonakis[at]gmail.com

 

Ταχυδρομική Διεύθυνση:
Εργαστήριο αρχαίου DNA
Ίδρυμα Τεχνολογίας και Έρευνας (ITE) Α΄ κτήριο ανατολικού συγκροτήματος ΙΤΕ (Κτήριο ENISA) Οδός : Νικολάου Πλαστήρα 95, Βασιλικά Βουτών ΤΚ 700 13 Ηράκλειο, Κρήτη ΕΛΛΑΔΑ

 

 

 

 

 

 

 

 

Καλώς ήλθατε στο Εργαστήριο Αρχαίου DNA.

Το Εργαστήριο Αρχαίου DNA δέχεται φοιτητές για εκπόνηση προτυχιακής ή μεταπτυχιακής εργασίας, όπως και υποψήφιους διδάκτορες για εκπόνηση της διδακτορικής τους διατριβής. Οι ενδιαφερόμενοι παρακαλούνται να επικοινωνήσουν με τον Υπεύθυνο του εργαστηρίου (Νίκος Πουλακάκης).